Oleh : Djoko Santosa, S.Si., M.Si.

Dosen Mata Kuliah Dan Praktikum Kultur Jaringan Tanaman – Fakultas Farmasi UGM

KULTUR KALUS, KULTUR PROTOPLAS DAN MIKROSPORA


1. Pendahuluan

Setelah mengikuti kuliah pada bab ini mahasiswa akan mampu mengetahui prinsip budidaya in vitro, membedakan jenis-jenis kultur dan tujuan masing-masing kultur.

2. Kultur jaringan sebagai alat budidaya tumbuhan obat

Kultur jaringan adalah budidaya organ, jaringan, sel atau bagian sel di dalam suatu media yang sesuai secara aseptik dengan tujuan tertentu yang sifat-sifatnya akan sama dengan sifat genetik induknya.

Teknik kultur jaringan mempunyai kelebihan dan juga kekurangan. Kelebihan teknik ini dibandingkan dengan teknik budidaya secara konvensional antara lain : tidak tergantung musim, tidak membutuhkan lahan luas, mampu menghasilkan tanaman jumlah besar dan waktu yang singkat, dapat digunakan untuk membudidayakan jenis-jenis tertentu yang secara konvensional tidak dapat dilaksanakan. Meskpun demikian ada beberapa kekurangan antara lain : biaya mahal, membutuhkan keahlian khusus dan risiko tinggi untuk jenis-jenis kultur tertentu.

Jenis media yang digunakan berupa media buatan yang sudah disesuaikan dengan kebutuhan hara, antara lain : Murashige-Skoog (MS),  Woody Plant Medium (WPM), Nitsch & Nitsch, N6, A2,  B5, dan Vancin-Went (VW). Masing-masing media mempunyai spesifikasi berbeda-beda dan digunakan untuk pengerjaan jenis kultur yang berbeda-beda pula. Sebagai contoh, media VW biasanya untuk jenis kultur anggrek, WPM untuk jenis tanaman keras, A2 untuk  kultur mikrospora dan kultur protoplas, N6 untuk jenis serealia, meskipun demikian ada jenis media yang umum untuk jenis-jenis Angiospermae yaitu media Murashige-Skoog.

Semua media, peralatan kultur dan alat untuk menanam harus dalam keadaan steril. Oleh karena itu ruang laboratorium juag diatur sedemikin rupa sehingga di dalamnya mempunyai keadaan aseptik.

3. Jenis-jenis kultur

Jenis-jenis kultur yang dilakukan di laboratorium meliputi : kultur tunas, kultur kalus, kultur sel, kultur mikrospora dan kultur protoplas.

Kultur tunas sebetulnya mirip dengan stek jika dilakukan secara konvensional. Dalam kultur ini diambil bagian yang bersifat meristematik seperti ujung batang atau bagian ketiak daun. Potongan tersebut selanjutnya ditanam di media.

Jenis kultur ini sesuai untuk mikro propagasi yaitu untuk menghasilkan jenis tumbuhan dalam jumlah besar dalam waktu singkat. Seringkali meskipun telah tumbuh banyak tunas tanaman dalam botol kultur tetapi belum muncul perakaran sehingga kultur yang bersangkutan perlu dipindah ke media yang mampu menghasilkan perakaran. Zat pengatur tumbuh seperti 2,4 D dalam konsentrasi tertentu mampu menginisiasi perakaran.

Jenis kultur kedua adalah kultur kalus. Kultur kalus mensyaratkan eksplan yang ditanam harus diberi pelukaan. Tujuan pelukaan (wounding) ini adalah mendeferensiasikan kembali jaringan yang telah dewasa dalam arti menjadikan jaringan bersifat merstemoid lagi setelah jaringa tersebut dewasa. Jika sepotong daun dilukai maka pada umur kultur tertentu di bagian yang dilukai akan tumbuh benjolan-benjolan kecil berwarna putih yang dinamakan kalus. Sebetulnya kalus adalah kumpulan sel yang besifat parenkematis sebagai akibat dari pembelahan sel yang tidak terkendali dan belum mengalami diferensiasi.  Meskipun pada umur tertentu dari  kalus akan menunjukkan diferensiasi ke arah organ.

Dalam bidang kefarmasian jenis kultur ini sesuai untuk mendapatkan metabolit yang diinginkan. Sebab pada umur tertentu dari kalus dapat dipanen untuk diambil metabolit sekundernya. Suatu langkah yang lebih cepat dalam produksi metabolit sekunder dibandingkan menanam secara konvensional dengan waktu tunggu yang lebih lama.

Sel-sel kalus yang dihasilkan dapat juga dijadikan sumber kultur sel atau dikenal dengan kultur suspensi sel. Berbeda dengan kultur kalus, kultur sel mengunakan media cair dalam pengerjaan kulturnya. Sel-sel kalus dipisahkan dari kelompoknya sehingga menjadi sel tunggal yang ampu memproduksi metabolit sekunder jika ditempatkan pada media produksi.

Kalus yang terbentuk apabila akan dipakai sebagai sumber kultur sel harus segera dipisahkan dari sel-sel penyusunnya. Selanjutnya sel-sel tersebut kemudian diidspersikan ke dalam media cair untuk dikulturkan. Populasi sel tunggal dari  kalus yang terbentuk untuk kultur sel sebaiknya berjumlah  1-2,5 x 105 sel/ml.

Tujuan utama kultur sel adalah produksi metabolit sekunder tetapi sel-sel yang ada di dalam kultur kalus juga masih mempunyai kemampuan berdiferensiasi menjadi organ-organ tanaman. Sehingga hal ini harus dihindari dengan cara sel pada umur tertentu perlu dibuat ammobil atau dikenal dengan istilah immobilisasi sel. Semua sel yang telah diikat ini akan dapat dikulturkan lagi pada saat dibutuhkan.

Persilangan yang secara konvensional tidak dapat dilakukan dengan bantuan kultur jaringan hal ini dapat dilakukan. Teknik yang memungkinkan adalah dengan persilangan antar protoplas. Sebelum dilakukan fusi 2 macam protoplas yang berbeda perlu diisolasi terlebih dahulu kedua macam protoplas.

Protoplas adalah sel tumbuhan yang dihilangkan dindingnya. Cara penghilangan dinding dilakukan dengan pemberian enzim selulase dan sejenisnya. Organ daun yang masih muda disterilkan kemudian diiris-iris atau disobek sehingga terpisah antara bagian permukaan bawah dan atas daun. Setelah terpisal kemudian dimasukkan ke dalam larutan enzim dengan kadar tertentu dan ditunggu selama 12-18 jam. Selama itu sel-sel akan keluar dan dinding sel akan lisis sehingga didapatkan protoplas. Semua pengerjaan dilakukan secara aseptik.

Tanaman hasil persilangan dua macam protplas sudah banyak diteliti antara lain pomato, sebagai persilangan antara tomat dan kentang (Solanaceae). Penelitian lain dilakukan dnegan menyilangkan dua macam kloroplas (bukan protoplas), yaitu antara jagung dengan tebu (Poaceae). Harapan dari persilangan itu adalah mendapatkan semua bahan yang dapat dipakai manusia dalam satu individu. Jika pomato menghasilkan buah maka di bagian atas dapat dipanen buah tomat dan dari umbi batang dihasilkan kentang. Begitu pula dengan pesilangan kloroplas jagung dan tebu akan dihasilkan buah jagung dan batang untuk menghasilkan gula tebu dalam satu individu.

Rekayasa demikain juga dapat dilakukan untuk menghasilkan tanaman yang taha tehadap hama tetentu. Persilangan diharapkan berasal dari hama dan tanaman lokal Indonesia. Persilangan secara genetik yang berupa tanaman transgenik jika menggunakan semua sumber lokal dari negara kita sendiri dapat menurunkan tingkat kerusakan ekosistem jika tanaman transgenik sudah dibudidayakan.

Jenis kultur lain yang dapat dipakai untuk mendapatkan bibit unggul adalah kultur mikrospora. Mikrospora sebetulnya serbuk sari muda yang apabila dewasa dipakai untuk melakukan penyerbukan tanaman. Penyerbukan yang berhasil dan diikuti pembuahan akan menghasilkan biji dan dipakai untk melajutkan pergiliran keturunan berikutnya. Tetapi dengan teknik tertentu perkembangan ke arah gamet dewasa dari mikrospora dapat dicegah dan justru dapat dipakai untuk sumber menghasilkan tanaman.

Dipilihnya mikrospora dengan alasan bahwa jumlahnya banyak, dalam satu kepala sari biasanya terdapat ribuan bahkan ratusan ribu mikrospora. Apabila perlakuan yang tepat dn mampu menghasilkan 75% embrioid maka dapat dibayangkan jumlah tanaman yang akan dihasilkan.

Kultur mikrospora menggunakan sel tunggal mikrospora sebagai sumber kulturnya. Kepala sari dibuka kemudian semua isi dikeluarkan sehingga didapatkan sl-sel tunggal mikrospora. Selanjutnya sel inilah yang dikulturkan dalam media cair.

Meskipun terdapat perbedaan, keduanya bertujan untuk menghasilkan jenis tanaman haploid yang mempunyai sifat-sifat berbeda dengan induknya. Sebagai contoh, tembakau dengan nikotin yang tinggi dapat diupayakan untuk ditekan dengan dihasilkannya jenis tembakau haploid (n) yang sudah digandakan kromosomnya menjadi tembakau bihaploid (n+n). Bedakan tanaman dengan kromosom haploid (n), bihaploid (n+n) dan tanaman diploid (2n) !

Terbentuknya mikrospora diawali dengan perubahan-perubahan yang terjadi di dalam mikrosporangium. Di dalam mikrosporangium inilah serbuk sari dibentuk dan berkembang. Pada saat kepala sari masih muda, terdapat jaringan yang homogen berada di bawah epidermis. Jaringan tersebut dikenal dengan nama jaringan arkesporium yang bersifat meristematik. Arkesporium ini selanjutnya akan berperan dalam pembentukan mikrospora.

Jaringan arkesporium membelah secara periklinal menghasilkan sel-sel sporogen primer dan sel-sel parietal primer. Sel sporogen langsung menjadi sel induk mikrospora. Melalui pembelahan meiosis, satu sel induk mikrospora akan dihasilkan empat mikrospora haploid. Mikrospora ini bersatu membentuk mikrospora tetrad.     Terbentuknya mikrospora melalui pembelahan meiosis yang terdiri 2 tahap. Tahap pertama,  sel induk spora membelah secara meiosis  karena dari satu sel (dengan 2n kromosom) menjadi 2 sel dengan masing-masing n kromosom. Pembelahan kedua, sel akan membelah secara meiosis ( sebetulnya sama dengan  pembelahan mitosis biasa) pembelahan satu sel dengan n kromosom menjadi 2 sel dengan n kromosom. Hasil keseluruhan dari dua tahap pembelahan itu adalah 4 sel dengan n kromosom.

Pembelahan  meiosis sel induk mikrospora dibedakan menjadi 2, yaitu secara simultan menghasilkan bentuk tetrad yang bertipe tetrahidris dan secara suksesif menghasilkan bentuk tetrad isobilateral. Tumbuhan anggota kelas Dicotyledoneae mempunyai tetrad tipe isobilateral sedangkan anggota tumbuhan kelas Monocotyledoneae mempunyai tetrad tipe tetrahidris. Pada perkembangan selanjutnya mikrospora dalam bentuk tetrad akan lepas menjadi bentuk tunggal.

Dinding kepala sari tersusun dari jaringan epidermis, endotesium, lapisan tengah dan tapetum. Tapetum merupakan lapisan terdalam dari dinding anter. Pada saat serbuk sari masih muda, sel-sel tapetum mempunyai inti yang jelas dan kaya akan plasma. Lapisan ini berfungsi untuk memberi makanan kepada sel-sel sporogen. Ada dua cara lapisan tapetum memberi makanan kepada sel-sel sporogen, yaitu secara plasmodial dan sekretorial. Secara plasmodial, tapetum memberi makanan kepada sel sporogen dengan cara mengeluarkan seluruh isi protoplas ke dalam lokulus dan dinding sel tapetum mengalami lisis. Protoplas dari tapetum bersatu dengan protoplas yang terdapat di dalam lokulus yang kemudian menyelubungi sel induk mikrospora. Secara sekretorial, sel-sel tapetum akan memberi makanan kepada mikrospora dengan mengeluarkan isi selnya secara bertahap (slow release). Dinding sel tapetum tidak lisis tetapi sudah tidak dapat terlihat lagi ketika akhir perkembangan mikrospora.

Mikrospora yang masih muda hanya berinti satu, inti terletak di tengah. Fase ini kemudian dinamakan fase mononuklear atau stadium uninukleat. Tahap perkembangan selanjutnya mikrospora mengalami pembesaran ukuran dan mempunyai sebuah vakuola. Stadium ini disebut stadium vacuolated. Semakin besar vakuola, inti semakin terdesak ke arah tepi. Stadium demikian dinamakan  uni-nukleat akhir.

Stadium perkembangan mikrospora dapat dibedakan menjadi beberapa fase, yaitu :

  1. Uni-nukleat sangat awal, dicirikan oleh inti mikrospora di tengah, dinding mikrospora sangat tipis dan tanpa vakuola.
  2. Uni-nukleat awal, dicirikan oleh inti mikrospora di tengah, dinding sudah semakin kuat dan vakuola kecil bentuk sferik.
  3. Uni-nukleat tengah awal, dicirikan oleh sebgian besar inti mikrospora di tengah sedangkan sebagian kecil inti mikrospora di tepi, vakuola besar.
  4. Uni-nukleat tengah, hampir sama dengan uninukleat tengah awal tetapi ukuran vakuola dua kali ukuran vakuola pada stadium sebelumnya.
  5. Uni-nukleat akhir, dicirikan oleh hampir semua mikrospora mempunyai inti di tepi, pada beberapa jenis sudah berkembang menjadi stadium 2 inti, vakuola besar berbentuk bulat telur.

Perkembangan selanjutnya, setelah stadium uni-nukleat akhir inti akan mengalami pembelahan secara mitosis menghasilkan 2 inti, yaitu inti generatif (berukuran lebih kecil) dan inti vegetatif yang berukuran lebih besar.  Fase demikian disebut stadium binukleat atau disebut pula stadium biselular. Pada tahap ini mikrospora  sudah mencapai akhir perkembangannya sehingga dapat disebut serbuk sari.  Perkembangan berikutnya inti generatif membelah secara mitosis menghasilkan 2 inti sperma. Sehingga jumlah inti menjadi 3 buah. Pembelahan inti generatif dapat berlangsung di dalam serbuk atau di dalam buluh serbuk sari yang berkecambah pada peristiwa penyerbukan.

Salah satu keberhasilan androgenesis ditentukan oleh pemilihan stadium perkembangan dari serbuk sari. Beberapa faktor lain yang juga berpengaruh antara lain kondisi tanaman donor, cara isolasi mikrospora dari kepala sari, stres fisiologi dan medium dengan suhu inkubasi. Tetapi syarat-syarat kondisional tersebut sangat tergantung pada setiap jenis tanaman dan genotipnya.